Obiettivi formativi
- Apprendimento dei principi teorici del funzionamento delle principali tecniche di analisi di biomolecole, in particolare acidi nucleici e proteine.
- Interpretazione, valutazione ed elaborazione dei dati analitici.
- Conoscenza delle principali applicazioni in campo chimico, clinico-biologico e diagnostico.
- Lo studente:
- dovrà acquisire i principi di riconoscimento biomolecolare che sottendono allo sviluppo di metodi bionanalitici e biosensori, tra cui interazioni tra acidi nucleici, interazioni antigene-anticorpo e ligando-proteina.
- dovrà apprendere le principali tecniche molecolari di determinazione di biomolecole, incluse tecniche di amplificazione molecolare e saggi immunologici.
- dovrà conoscere le principali tecniche analitiche strumentali di spettrometria di massa disponibili per la determinazione di biomolecole, inclusa la strumentazione, le modalità di acquisizione e l’interpretazione degli spettri.
- dovrà acquisire le competenze necessarie per interpretare il dato analitico e valutare le potenzialità e le criticità di un metodo;
- dovrà sviluppare capacità creativa nell’applicare le nozioni ricevute a problemi di bioanalitica.
- dovrà sviluppare adeguate capacità comunicative e dimostrare di aver acquisito la corretta terminologia.
- dovrà dimostrare di saper utilizzare in autonomia e con senso critico il materiale didattico fornito dal docente, di saper reperirne altro in modo autonomo, e di saper interfacciarsi con la letteratura scientifica rilevante.
Contenuti dell'insegnamento
Richiami e complementi di tecniche strumentali per la generazione di segnali analitici: spettrofotometria assorbimento UV-vis, spettrofotometria di emissione in fluorescenza, tecniche elettroanalitiche in voltammetria.
Fondamenti di DNA nanotechnology e applicazioni bioanalitiche: meccanismi di reazione tra acidi nucleici sintetici, strutture statiche e dinamiche, architetture e sensori molecolari.
Amplificazione di acidi nucleici: tecniche enzimatiche, tecniche non enzimatiche, tecniche basate su tecnologie CRISPR-Cas.
Saggi immunologici: principi biochimici e curve di Langmuir, saggi enzimatici, saggi in fluorescenza, tecnologie di tipo lateral flow.
Gel elettroforesi: separazione di acidi nucleici e proteine.
Spettrometria di massa per analisi di biomolecole: principi generali, sorgenti di ionizzazione, analizzatori, modalità di acquisizione qualitative e quantitative, spettrometria di massa tandem, cenni generali di proteomica, tecniche combinate con cromatografia liquida.
Valutazione del dato analitico: parametri per la validazione di metodi analitici e l’interpretazione di test diagnostici.
Esercitazioni in laboratorio: saggi ELISA, rivelazione elettrochimica di DNA, spettrometria di massa.
Programma esteso
Richiami e complementi di tecniche strumentali per la generazione di segnali analitici: 1) spettrofotometria assorbimento UV-vis - interazione tra radiazione elettromagnetica e molecole, transizioni elettroniche, bande di assorbimento, trasmittanza e assorbanza, legge di Lambert-Beer, limitazioni e deviazioni, strumentazione; 2) spettrofotometria di emissione in fluorescenza - origine del fenomeno di fluorescenza e fosforescenza, diagramma di Jablonsky, Stokes shift, regola di Kasha, mirror image rule, lifetime e resa quantica, meccanismi di quenching, equazione di Stern-Volmer, strumentazione, misure quantitative in fluorescenza; 3) tecniche elettroanalitiche in voltammetria - voltammetria, cella di misura, corrente e velocità di reazione, trasporto all’elettrodo e corrente limite, misure quantitative, correnti faradiche e di carica, voltammetria pulsata, sensori elettrochimici, voltammetria ciclica.
Fondamenti di DNA nanotechnology per applicazioni bioanalitiche: interazioni tra acidi nucleici e strutture complesse (duplex, triplex, stem-loop hairpin, junctions, origami); aptameri e processo SELEX; acidi nucleici artificiali (PNA e LNA); meccanismi dinamici di reazione in functional DNA nanotechnology (strand displacement, toehold-exchange), DNA switches.
Amplificazione di acidi nucleici: tecniche di amplificazione enzimatiche (PCR, RT-PCR, LAMP, RCA, RPA, NASBA), tecniche di amplificazione non enzimatiche (HCR, CHA), tecniche basate su tecnologie CRISPR-Cas.
Saggi immunologici: interazioni antigene-anticorpo, principi biochimici, derivazione di curve di binding di tipo Langmuir, saggi enzimatici ELISA diretti, indiretti e sandwich, ELISA competitivo, saggi in immunofluorescenza; tecnologie lateral flow.
Principi di gel elettroforesi: separazione di DNA su gel in agarosio; separazione di proteine e acidi nucleici su gel nativi e denaturanti in poliacrilamide.
Spettrometria di massa per analisi di biomolecole: principi e nozioni generali; sorgenti ESI; analizzatori quadrupolo, TOF, trappola ionica, FT-ICR, Orbitrap; spettrometria di massa tandem e relative modalità di acquisizione; tecniche combinate cromatografia liquida-spettrometria di massa LC-MS (RP-HPLC e SEC), cenni generali di proteomica bottom-up e frammentazione peptidi; spettrometria di massa MALDI.
Valutazione del dato analitico: parametri analitici e di validazione (precisione, esattezza, accuratezza, linearità, range dinamico, LOD/LOQ, sensibilità, selettività, specificità); interpretazione test sierologici (specificità e selettività, PPV, NPV, prevalenza).
Esercitazioni in laboratorio: saggi ELISA, rivelazione elettrochimica di DNA, spettrometria di massa.
Bibliografia
Materiale fornito dal docente.
Articoli su riviste indicate dal docente durante il corso.
Per la parte di spettrometria di massa: “Mass Spectrometry: principles and applications”, E. de Hoffmann, V. Stroobant; Wiley.
Metodi didattici
Lezioni Frontali
Esercitazioni in laboratorio: saggi ELISA, sensori a DNA elettrochimici, spettrometria di massa
